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質問 |
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| 質問者：maumau18 | ロイシン ウリジンの取り込みについて | |
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困り度：
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細胞に薬剤を入れて、タンパクとRNA合成が どのように変化するかという実験をしています。 今まで私が所属しているところでは RIのみ（0.67μM）を加えて一時間インキュベートを していましたが、これだと取り込み量が少ない ので、コールドのロイシン、ウリジンを加えようと いうことになりました。 とりあえず１０μMを加えて実験をしなさいと の支持で実験をしてみたのですが、 適正の濃度ではありませんでした。 もし同様の実験をされている方がいらしたら 加えるコールド（RIでない）のロイシンと ウリジン濃度を教えていただきたいのですが。 よろしくお願いします。 |
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質問投稿日時：05/10/19 11:11 質問番号：1721570 |
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この質問に対する回答は締め切られました。
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回答良回答20pt |
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| 回答者：Sbacteria | >反応をとめて細胞を集め、洗い、細胞のペレットをいきなり５％TCA処理して（界面活性剤はなにも加えません）、それを遠心もせずにGF/F フィルターにトラップさせてそれをカウントしています。 この方法だと、高分子に取り込まれたものだけでなく、膜胞（一番大きいものが細胞膜）に取り込まれたものすべてがトラップされます。フィルターを洗う時の洗浄液を工夫すれば、それでも良いかもしれませんが．．．．この実験だと、取り込み活性の測定を観ているだけのような気がします。面倒でも、細胞破砕のステップを入れる事をすすめます。 例えば、1mM Leu、5% SDSを含むPBSで懸濁して、一定時間インキュベートし、それからTCA沈殿させ（フィルターだけでも良いです）、そのフィルターを1mM Leuを含むPBSで十分洗って、フィルターのカウントを測定してごらんなさい。コールドのロイシンで洗うのは、吸着しているモノマーを交換するためです。タンパク質に取り込まれたLeuは入れ替わりませんから、高分子に取り込まれたホットの量（これが調べたいタンパク質合成量）はそのままで、バックを減らす事ができます。 今測定している、カウントから計算して、通常のタンパク質合成量に合いますか？おそらく、その何十倍かあるのでは？ |
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| 種類：アドバイス どんな人：専門家 自信：自信あり |
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回答日時：05/10/20 14:56 回答番号：No.3 |
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| この回答へのお礼 | どうもありがとうございます。 今 上の人たちが不在なので来週実験に ついて話をしたいと思っています。 もっとおうかがいしたいことが出てくる と思うので、まだ締め切らずにいさせて もらいます。 またお願いします。 |
回答 |
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| 回答者：Sbacteria | ＞培地はES mediunm 2%FBSです。 と言うことは、培地中に既に十分量のLeuは含まれているということですね。それなら、少量のホットのLeuを加えても十分なはずです。 次は、どういう操作をして、何の放射活性を計っていて、それがどうなっているのか？（文章を読んだだけでは、何が悪いのか全く理解できません）説明してください。 ある薬剤を加えた実験系 Iと加えない（あるいは薬剤だけ抜いたものを加える）実験系 IIを比較するとします。 まず、最初に薬剤が細胞の生育に影響があるか調べ、濃度依存性を調べておきます（ここまではやってあるのですね？）。薬剤の効果の何をみたいのかがさっぱり分からないので、想像するしか無いですが、生育阻害が観察できるぎりぎりの濃度で、実験して、実験系I, IIの両方にホットのLeuを加えます。 次に、一定時間後、コールドのLeuを大量に添加して、細胞をプレートから剥離して、遠心で集めます。ここからは、（１）界面活性剤を十分に含んだ溶液に溶かして、SDS-PAGEにかけ、高分子への取り込みをオートラジオグラフィーで観察する か、 （２）界面活性剤で抽出した溶液（軽い遠心でデブリスは捨てる）を酸変性させて、高分子をフィルターでトラップして、トラップされた放射活性をシンチレーターで測定する。 の２つがあり得ますが、（１）の方が実験としては面白いと思います。 想像で手順を書きましたが、実際はどうしているのでしょうか？ |
|---|---|
| 種類：アドバイス どんな人：専門家 自信：自信あり |
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回答日時：05/10/19 16:58 回答番号：No.2 |
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| この回答への補足 | たびたびありがとうございます。 使用している薬剤はｍRNAのハイプシン化の 阻害をしるのではないかと考えられています。 薬剤の濃度等は以前の学生が実験をして 論文を出しています。 ｍRNAの量の違いをみるまえに、total RNAと タンパク合成量の違いをみようということに なっています。 薬剤を入れて一時間カルチャー後に、コールドの ウリジン、ロイシンそれぞれで、反応をとめて 細胞を集め、洗い、細胞のペレットをいきなり ５％TCA処理して（界面活性剤はなにも 加えません）、それを遠心もせずに GF/F フィルターにトラップさせてそれを カウントしています。 デブリスっていうのは細胞片ということでしょうか？ それごとトラップしています。 これまでもこの研究室ではこういう 方法で実験をしていましたが、どうなんでしょう？ 改善すべき点等教えていただけますでしょうか。 よろしくお願いいたします。 |
| この回答へのお礼 | この回答にお礼をつける(質問者のみ) |
回答 |
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| 回答者：Sbacteria | 培養している細胞は何か？その遺伝子型は？ 使用している培地の組成は？ これらが記述されていないと一般論で話をするしかありません。 通常は、ロイシンはNa+とのシンポートで細胞内に輸送されるので、使用している生物のLeu/Na synporter のLeuに対するKmが分かっていれば、その3-5培程度入っていれば十分だと思います。 適正かどうかは、どうやって判断していますか？ |
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| 種類：アドバイス どんな人：専門家 自信：自信あり |
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回答日時：05/10/19 12:52 回答番号：No.1 |
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| この回答への補足 | Km値は以前はかったことがあるとかないとか で、わかりません。 細胞は mouse mammary carcinoma FM3A cellを つかっています。培地はES mediunm 2%FBSです。 １０μMでしなさいと指示をされ、間違えて 一回目は１００μM加えてしまいまして、次に １０μMで実験をしたところ、ロイシンに関しては RIのシンチレーションのカウントがほとんど 変わらないので、１００μM以上入れなさいと 次回の実験の指示がでました。 （以前コールドのロイシンを加えなかったときに 比べるとカウントは3分の１下がっています） ウリジンに関しては、１０、１００両者とも コールドを加えないときの実験のときと カウントが変わらないので、これももっと 増やしてするように言われています。 |
| この回答へのお礼 | この回答にお礼をつける(質問者のみ) |
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